Nguyên lý đo quang

Các thiết bị xét nghiệm sinh hóa là một dạng của máy quang phổ chuyên dùng cho nghành y, máy quang phổ được chế tạo từ những năm đầu thế kỷ 19 dựa trên định luật hấp thụ Bouger Lambert Beer.

Cường độ chùm sáng đơn sắc khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ tỉ lệ nghịch với chiều dày của lớp dung dịch nó đi qua

Sự giảm cường độ ánh sáng khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ phụ thuộc vào số lượng các tiểu phân tử vật chất hấp thụ mà ánh sáng gặp phải trên đường đi, nghĩa là phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch chất hấp thụ

Như ta biết mật độ quang D, tỉ lệ với nồng độ C của dung dịch theo biểu thức:

D=ep. C. L

D: mật độ quang học của dung dịch ( chính là hiệu của cường độ tia ló với cường độ tia tới khi đi qua dung dịch)

ep: Hệ số tắt của dung dịch

C: Nồng độ dung dịch

L: Chiều dày lớp dung dịch mà chùm tia sáng đi qua

Trong các tham số trên, hệ số tắt ep là không đổi, chiều dày lớp dung dịch L cũng không đổi, bản chất dung dịch và bước sóng không đổi, nên mật độ quang D chỉ còn phụ thuộc vào nồng độ dung dịch C

Định luật Bouger-Lambert-Beer khá chính xác với các nồng độ thấp, do đó trong trường hợp dung dịch loãng ta có thể ứng dụng tốt định luật để tính nồng độ dung dịch. Đôi với các dung dịch đạm đặc, định luật không còn chính xác nữa, khi đó D không còn tuyến tính với C nữa (mặc dù cố định). Khi đó, ta thường dùng phương pháp pha loãng dung dịch này sao cho nồng độ giảm xuống khoảng tuyến tính của hàm, đo như bình thường để xác định nồng độ dung dịch được pha loãng, từ đó tính toán ngược lại thu được nồng độ dung dịch ban đầu.

Từ hàm trên có thể coi :   C = D x K (factor)

Để tính K, người ta sử dụng mẫu chuẩn std ,có nồng độ Cstd xác định trước, đo mật độ quang Dstd để tính K, theo đó:

Csample = Dsample x K = Dsample x (Cstd / Dstd)

Các phép đo quang

Phép đo điểm cuối (Endpoint)

Là phép đo mật độ quang D của dung dịch chất thử  mà trong quá trình thực hiện phản ứng xảy ra hoàn toàn sau một thời gian nhất định. Tại thời điểm đó phản ứng kết thúc và tạo ra phức hợp màu đặc trưng và bền vững.

Sau khi ủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn, đo mật độ quang D của bệnh phẩm, từ đó tính được nồng độ của bệnh phẩm

Csample = Dsample x K = Dsample x (Cstd / Dstd)

Trong hóa sinh lâm sàng, tất cả các xét nghiệm có phản ứng tạo mẫu đặc trưng, việc chọn bước sóng (kính lọc ) phù hợp là việc làm bắt buộc. Hiện nay, hầu hết các xét nghiệm hóa sinh hiện đại, người ta sử dụng các loại thuốc thử với chế phẩm enzym, sản phẩm của phản ứng mầu thường được thể hiện dưới dạng mầu hồng cánh sen, thích hợp cho việc chọn kính lọc có bước sóng 500 - 546 nm, hoặc dưới dạng phức hợp mầu xanh lục thích hợp cho việc lựa chọn kính lọc có bước sóng 578 - 620 nm.

Riêng kỹ thuật xét nghiệm Bilirubin toàn phần và Bilirubin trực tiếp trong huyết thanh là xét nghiệm sử dụng phép đo điểm cuối nhưng phải dùng “trắng“ bệnh phẩm (End point with sample blank)

Sở dĩ là như vậy vì bản chất huyết thanh nhiều Bilirubin có mầu vàng, làm thay đổi mật độ quang dung dịch. Mỗi người bệnh có nồng độ Bilirubin khác nhau, nên mỗi bệnh nhân khi làm xét nghiệm Bilirubin máu, đều kèm theo việc xác định MĐQ trắng của bệnh phẩm (Sample blank).

Phép đo Endpoint được sử dụng cho hầu hết các xét nghiệm sinh hóa máu:định lượng Glucose, protein, Albumin, Cholesterol, Triglycerid, HDL_c, LDL_c, Ure ( so màu ), Bilirubin

Phép đo động học 2 điểm ( Two point kinetic - Fix time)

Phép đo này sử dụng cho các xét nghiệm hóa sinh có phản ứng xảy ra không hoàn toàn sau một thời gian nhất định. Không thể xác định điểm kết thúc của phản ứng

Tại thời điểm t1, đo mật độ quang D1

Tại thời điểm t2, đo mật độ quang D2

Hiệu số mật độ quang deltaD=D2-D1

Nồng độ bệnh phẩm Csample =  deltaD x K = deltaD x (Cstd / Dstd)

Phép đo động học 2 điểm thường được sử dụng để tính toán nồng độ Urea và Creatinin máu

Phép đo động học Enzyme ( Enzyme Kinetic)

Phép đo này sử dụng cho các xét nghiệm hóa sinh tìm hoạt độ các enzym trong huyết thanh.Phản ứng enzym thường không tạo phức hợp mầu mà làm thay đổi độ đục của dung dịch phản ứng trong khoảng thời gian nhất định. Việc xác định hoạt độ của enzym không thể xác định bằng phép đo điểm cuối mà phải sử dụng phép đo động học ở nhiều thời điểm ( t1, t2, t3, ..., tn ), thông thường đo ở 5 thời điểm t1 = 30s, t2 = 45s, t3 = 60s, t4 = 75s, t5 = 90s

deltaD1= D2-D1

deltaD2= D3-D2

deltaD3= D4-D3

deltaD4= D5-D4

deltaD=( deltaD1+deltaD2+deltaD3+deltaD4)/4

Hoạt độ enzyme: U/L= deltaD x K (factor do nhà sản xuất cung cấp)

Phép đo động học Kinetic thường được sử dụng cho các xét nghiệm: GOT,GPT,Amylase,CK,CkMb